اضافه نمودن ۳۰۰ میکرولیتر- N-lysis به رسوب برجای مانده وپیپتینگ آن جهت لیزشدن هسته سلول­ها .سپس به مدت ۲ساعت در دمای آزمایشگاه قرارداده شد.
اضافه نمودن۲۵۰ میکرولیتر- NaCl اشباع وورتکس نمودن آن جهت حذف پروتیین­ها.
اضافه نمودن ۶۰۰میکرولیترکلروفرم وورتکس نمودن آنها وسپس نمونه­ها با دور rpm 4500 به مدت ۴ دقیقه سانتریفوژ شد) به منظور جداشدن DNA ازسایرقسمت­ها به واسطه تشکیل دوفاز مختلف(.
جدا کردن مایع رویی حاوی DNA و منتقل کردن آن به یک میکروتیوپ استریل دیگر به نحوی که با کلروفرم زیر آن مخلوط نشود.
اضافه کردن۱۰۰۰میکرولیتر اتانول مطلق سرد برای کریستاله کردن DNA ، سپس درب ویال را با پارافیلم پوشانده و به مدت ۲۴ ساعت در یخچال نگهداری شد.

مرحله دوم
جهت رسوبDNA روز بعد ابتدا نمونه­ها درrpm 10000به مدت۲ دقیقه سانتریفوژ شد. اگرDNA مشاهده نشد به مدت ۲۰ دقیقه با دور ۱۴۰۰۰ rpm سانتریفوژ می­ شود.
سپس مایع رویی را دور ریخته و شستشوی نهایی با الکل۷۰درصد به مقدار ۲۵۰ میکرولیتر انجام می­دهیم. )این عمل را تا سه بارتکرارمی­کنیم و هر بار درrpm 10000به مدت دو دقیقه سانتریفوژ می­کنیم (. درآخرین شستشو الکل را دور ریخته و درب ویال را باز گذاشته تا الکل کاملاخشک شود.
اضافه کردن۷۰ تا۱۰۰میکرولیتر آب مقطر جهت حل شدن رسوب DNA.
٣-٣) سنجش کیفیت و کمیتDNA
١-٣-٣) سنجش کمیت و کیفیت DNA با بهره گرفتن از نانودراپ
کیفیت و کمیت تمام نمونه های DNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ، با نسبت OD 260/280 (نشانگر خلوص) انجام شد. برای این کار بعد از صفر کردن دستگاه با آب مقطر، ۵ میکرولیتر از DNA متعلق به هر یک از نمونه ها به جایگاه مخصوص در دستگاه نانودراپ منتقل شد.
اگر نسبت مقدار جذب محلول DNA در طول موج ٢۶٠ نانومتر به مقدار جذب در طول موج ٢٨٠ نانومتر در محدوده ٢- ٨/١ باشد، نشان دهنده این است که جذب عمدتا به علت اسید نوکلئیک است و کیفیت و خلوص DNA مطلوب است. اعداد کمتر از ٨/١آلودگی پروتئین یا فنلی را نشان می­دهد و اعداد بالاتر از ٢ نشان دهنده آلودگی RNA هستند.
٢-٣-٣) ارزیابی کیفیت DNA استخراج شده به کمک ژل آگارز (الکتروفورز افقی)
مواد و تجهیزات مورد استفاده جهت ارزیابی کیفیت DNA استخراج شده به کمک ژل آگارز
مواد لازم:
بافر TBE با غلظت ۱x
پودر آگارز (شرکت زیست فناوری کوثر)
بافر لودینگ
DNA استخراج شده
پودر ساکارز (محصول شرکت Merk)
بروموفنول بلو )محصول شرکت Sigma)
سایبرگرین (محصول شرکت Bioron)
تجهیزات لازم:
بشر
هیتر برقی (Persia shimi)
سینی ژل و شانه (محصول شرکت پایا پژوهش پارس)
تانک الکتروفورز (محصول شرکت پدیده نوژن پارس)
منبع تغذیه (محصول شرکت فن آوران سهندآذر)
دستگاه ترانس لومیناتور (محصول شرکت کیاژن)
سمپلر(محصول شرکتsocorex )
سر سمپلر
مگنت مغناطیسی (Persia shimi)
نانو دراپ (ترمو ساینتفیک آمریکا)
طرز تهیه بافرها
الف) بافر x ١٠ TBE
مقدار ۵/٧ گرم EDTA در ۵٠ میلی لیتر آب مقطر حل کرده و به مخلوط حاصل ٩٩/١٠٨گرم Tris base و ۶۵/۵۵گرم Boric acid اضافه کرده و توسط آب مقطر به حجم ١٠٠٠میلی لیتر رسانده شد.
جهت تهیه بافر TBE با غلظت ۱x، ١٠٠ میلی لیتر بافر x ١٠ TBE را با ٩٠٠ میلی لیتر آب به حجم ١لیتر رسانده شد.
ب) بافر لودینگ
مقدار ۵٠٠ میکرولیتر لودینگ بافر و ۵٠٠ میکرولیتر (Dmso)Dimethyl sulphoxide به ۵ میکرولیتر سایبرگرین اضافه شده و به میزان بسیار اندک پودر بروموفنل بلو در این مخلوط حل گشت. لازم به ذکر است برای تهیه­ لودینگ بافر ۵٠٠ میکرولیتری اولیه ۴٠ گرم ساکارز ۴٠٪ همراه با ٢ ، ۵ گرم بروموفنول بلوی ٢۵٪ با آب مقطر به حجم ١٠٠میکرولیتر رسانده شد و محلول حاصل برای ساخت بافرلودینگ در دمای ۴ درجه نگه داری شد.
روش کار
(١) پس از رفع آلودگی ها با بهره گرفتن از الکل، دو سمت سینی مخصوص ژل را با بهره گرفتن از چسب نواری به طور محکم بسته و سپس شانه ژل درون سینی قرار داده شد.
(٢) برای تهیه ۵٠ میلی لیتر ژل آگارز ٢درصد، ١ گرم پودر آگارز به همراه ۵٠ میلی لیتر بافر TBE1x در یک بشر ریخته شد و بشر بر روی هیتر قرار گرفت تا آگارز کاملا حل شود. جهت همگن کردن این محلول از مگنت مغناطیسی استفاده شد.
(٣) پس از این که محلول شفافی مشاهده گردید، بشر از روی حرارت برداشته شد و در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا کمی خنک شود. سپس درون سینی ژل ریخته شد تا ببندد.
(۴) پس از بسته شدن ژل، شانه به آهستگی برداشته شد و چسب های اطراف سینی باز گردید و سپسس سینی محتوی ژل درون تانک الکتروفورز قرار داده شد و مقداری بافر TBE-1 x درون تانک ریخته شد.
(۵) ۴میکرولیتر از DNA استخراج شده همراه با ٢ میکرولیتر بافر لودینگ مخلوط و با دقت درون چاهک های ژل تزریق شد.