فاز سوم الحاق: پس از اتصال اولیه بین باکتری و سطح، چه به صورت مستقیم و چه به صورت قرار گرفتن در شکاف‌‌‌‌، ‌‌یک مهار محکم بین باکتری و سطح می‌تواند تشکیل شود. این مهاربندی محکم ممکن است ناشی از پیوند کووالانسی،‌‌ یونی و ‌‌یا پیوند هیدروژنی شکل بگیرد. پس از چسبیدن، سایر ارگانیسم‌ها نیز شروع به ‌‌‌ترشح کردن ماده‌ای چسبناک کرده و خود را در ‌‌یک لایه از این ماده جا می‌دهند.
فاز چهارم کلونی، نشانه‌های بلوغ: هنگامی که اتصال محکم میکروارگانیسم‌ها شروع به رشد کرد و سلول‌های جدید متصل ماندند، بایوفیلم می‌تواند شروع به شکل‌گیری کند. در این مرحله سایر واکنش‌ها شامل quorum-sensing شروع به ایفای نقشی مهم می‌کنند.
در سطوح زبر، باکتری‌ها در برابر تنش برشی بهتر محافظت می‌شوند، بنابراین ‌‌یک تغییر از برگشت‌پذیر به برگشت ناپذیر راحت‌تر انجام می‌شود.

در این زمینه‌ هاجیم آنو و همکارانش به منظور افزایش نرخ واکنش‌های حذف کربن آلی محلول (DOC) و نیتروژن، از ‌‌یک کانال مستطیلی که در آن سرامیک متخلخل جهت الحاق میکروارگانیسم تعبیه شده بود، استفاده کردند. طول، عرض و ارتفاع کانال به ‌‌‌ترتیب ۱، ۰۲/۰ و ۰۲۵/۰ بود و حجم کلی پایلوت ۱۸/۰ لیتر بود. آن‌ها از فاضلاب مصنوعی با‌‌‌ ترکیبی نزدیک به فاضلاب خانگی استفاده کردند و جهت انجام آزمایش‌ها پایلوت را هم با هوادهی و هم بدون هوادهی راهبری کردند. جهت بررسی ساختار بایوفیلم از میکرو الکترود PH و DO استفاده کردند و به این نتیجه رسیدند که بایوفیلم تشکیل شده شامل ‌‌یک لایه هوازی درسطح و ‌‌یک لایه بی‌هوازی در قسمت‌های عمیق‌‌‌تر می‌باشد. لایه بایوفیلم تشکیل شده قادر به حذف کربن آلی، آمونیاک‌‌ یا نیتریت از فاضلاب بود]۴۷[.
کاو و همکارش جهت بررسی سینتیک تبدیلات بیولوژیکی هوازی و جامعه میکروبی غالب در شبکه‌های جمع‌ آوری فاضلاب، از ‌‌یک کانال بازچرخانی به عنوان پایلوت آزمایشگاهی استفاده کردند. فاضلاب مصنوعی به عنوان فاضلاب استفاده شده‌ بود. جهت ایجاد تمایز بین میزان فعالیت بایوفیلم و بایومس معلق، اکسیژن بیولوژیکی را برای‌‌‌‌اندازه گیری میزان فعالیت بایومس محاسبه کردند.
آن‌ها به این نتیجه رسیدند که فعالیت مخصوص بایومس معلق بیشتر از بایوفیلم تشکیل شده است، همچنین تفاوتی در میزان فعالیت بایوفیلم سطحی و قسمت‌های زیرین بایوفیلم مشاهده نکردند. نتایج آن‌ها نشان دهنده این موضوع بود که جمعیت میکروبی غالب رشته‌ای بود (اکثرا Sphaerotilus natans) و به دلیل سرعت پایین انتقال جریان رشد بایوفیلم اغلب سطحی بود]۴۸[.

مدل‌های حذف در شبکه‌های جمع‌ آوری فاضلاب
محققین با انجام تحقیقات آزمایشگاهی و مطالعات میدانی در زمینه‌ی فرآیندهای حذف در شبکه‌های جمع‌ آوری فاضلاب، مدل‌های تجربی برای این فرآیندها ارائه دادند. تبدیلات بیولوژیکی هتروتروفیک مواد آلی فاضلاب تحت شرایط هوازی، شامل مواد محلول و معلقی در شبکه‌های جمع‌ آوری ثقلی است که در جدول ۲-۲ نشان داده شده‌اند.
غلظت بایومس و سوبسترا در شبکه‌های جمع‌ آوری فاضلاب