در همه مراحل این تحقیق، از محیط کشت DMEM به عنوان محیط پایه محلول انجمادی استفاده شد. برای ساخت ۱۰۰ میلی لیتر محیط کشت DMEM، مواد زیر به ترتیب به آب دیونیزه اضافه شدند.

Deionized Water 100 ml
DMEM 1/35 gr
Penicillin / Streptomycin (Gibco; Paisley; UK) 1 ml (Penicilin1000unit/ml; Streptomycin 1000 µgr/ml)
NaHCo3 (Sigma; MO; USA) 0/37 gr
سپس pH محیط فوق توسط دستگاه pH متر، بین ۴/۷- ۲/۷ تنظیم شد و توسط فیلتر دارای منافذ با قطر ۲۲/۰ میکرومتر فیلتر و در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد.
۲-۲-۲-روش تهیه محلول های انجماد شیشه ای
انجماد شیشه ای با دو روش مختلف انجمادی (I و II) صورت پذیرفت، بدین منظور دو نوع محلول انجمادی تهیه گردید.
۲-۲-۲-۱-روش آماده سازی محلول انجمادی I
در این روش، سه محلول انجمادی با غلظت های افزایش DMSO^[36]و اتیلن گلیکول^[۳۷] تهیه شد. به این منظور ابتدا محلول انجمادی سوم با غلظت ۸/۲ مولار DMSO و ۱/۲ مولار اتیلن گلیکول در محیط پایه DMEM و بدون سرم تهیه گردید و سپس رقت های ۵۰% و ۲۵% از آن تهیه شد و در نهایت به کلیه ی محلول ها ۲۰% سرمFBS اضافه شد (۲۳).
۲-۲-۲-۲-روش آماده سازی محلول انجمادی II
در این روش پنج محلول انجمادی با غلظت های افزایشی اتیلن گلیکول تهیه گردید. محلول انجمادی اول حاوی محیط پایه ی DMEM،۱۰% اتیلن گلیکول و ۲۰%سرم FBS، محلول انجمادی دوم حاوی محیط پایه ی DMEM، ۵/۱۷% اتیلن گلیکول و ۲۰% سرم FBS، محلول انجمادی سوم حاوی ۲۵% اتیلن گلیکول در محیط پایه ی DMEM و ۲۰% سرم FBS، محلول انجمادی چهارم حاوی ۵/۳۲%اتیلن گلیکول، ۳/. مولار سوکروز در محیط پایه ی DMEM و ۲۰% سرم FBS و محلول انجمادی پنجم حاوی ۴۰% اتیلن گلیکول، ۶/. مولار سوکروز در محیط DMEM و ۲۰% سرم FBS بود (۳۷).
۲-۲-۳-مراحل انجماد شیشه ای
۲-۲-۳-۱-روش انجمادی I
قطعات بیضه ی شستشو داده شده در محیط DMEM حاوی ۲۰% سرم FBS، درون ویال های انجمادی ۵/۱ میلی لیتر قرار داده شدند و به ترتیب به مدت ۵، ۱۰ و ۱۰ دقیقه در محلول های انجمادی ۲۵%،۵۰% و۱۰۰% قرار گرفتند. در طی این زمانها، ویال های حاوی بافت و محلول انجمادی درون یخ و بر روی شیکر قرارداشتند تا امکان نفوذ بهتر محلول انجمادی به درون بافت فراهم آید. پس از اتمام مرحله ی سوم انجماد، بافت ها از محلول انجمادی سوم خارج شدند و سپس سریعا به کرایویال سرد شده منتقل شدند. کرایوویالها پس از غوطه وری سریع در نیتروژن مایع در تانک نیتروژن نگه داری شدند.
۲-۲-۳-۲-روش انجمادی II
قطعات بافتی به ترتیب به مدت ۳، ۲، ۵، ۹ و ۹ دقیقه در محلول های انجمادی ۱۰%، ۵/۱۷%، ۲۵%، ۳۲% و۴۰% اتیلن گلیکول شستشو داده شدند. پس از اتمام آخرین مرحله، بافت ها از محلول انجمادی پنجم خارج شدند و سپس سریعا به کرایویال سرد شده منتقل شدند. کرایوویالها پس از غوطه وری سریع در نیتروژن مایع در تانک نیتروژن نگه داری شدند.
۲-۲-۴-ذوب بافت بیضه
۲-۲-۴-۱-روش تهیه محلول های ذوب
ذوب نمونه ها در چهار مرحله انجام شد. محلول ذوب اول حاوی ۱مولار سوکروز (غلظت ۱۰۰% سوکروز) و ۲۰% سرم FBS در محیط پایه DMEMبود و محلولهای ذوب ۲، ۳ و ۴ نیز حاوی غلظت های ۵۰%، ۲۵% و ۵/۱۲% سوکروز، ۲۰%سرم FBS در محیط پایه DMEM بود (۲۳).
لازم به ذکر است پیش از ذوب نمونه ها، محلول ذوب اول به مدت چند ساعت در انکوباتور قرار گرفت تا به دمای ۳۷ درجه برسد.
۲-۲-۴-۲ مراحل ذوب
ابتدا کرایویال های حاوی نمونه از تانک نیتروژن خارج شدند و به مدت یک دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند. مراحل ذوب برای هر دو گروه انجمادی به ترتیب زیر انجام شد:
نمونه ها به ویال های حاوی محلول ذوب اول منتقل شدند و به مدت یک دقیقه در آن قرار گرفتند.
سپس نمونه ها به مدت پنج دقیقه در ویال حاوی محیط ذوب ۵۰% شستشو داده شدند.
در مرحله ی بعد، نمونه ها به مدت پنج دقیقه در ویال حاوی محلول ذوب ۲۵% شستشو داده شدند.
سپس نمونه ها به مدت پنج دقیقه در ویال حاوی محلول ذوب ۵/۱۲% شستشو داده شدند.
پس از اتمام مراحل ذوب، قطعات بافتی به مدت ۳۰ دقیقه در محلول DMEM حاوی ۲۰%سرم FBS قرار گرفتند تا از شوک های حاصل از انجماد و ذوب، ترمیم یابند.
کلیه ی مراحل فوق به غیر از مرحله ی اول بر روی یخ و شیکر انجام شد.
۲-۵-مطالعات میکروسکوپی و بافت شناسی بافت بیضه
قطعات بیضه در گروه کنترل و انجمادی I و II پس از انجام مراحل ذکر شده در بالا طبق مراحل زیر آماده سازی و سپس رنگ آمیزی شدند.
ثبوت: برای ثبوت بافتی، قطعات بیضه به مدت ۲۴ ساعت در محلول بوئن و ۴۸ ساعت در فرمالین قرار گرفتند.
آب گیری: در این مرحله نمونه ها وارد دستگاه پاساژ شدند و با درجات صعودی الکل اتیلیک آبگیری صورت گرفت.
آماده سازی جهت نفوذ پارافین: نمونه ها دو نوبت و هر بار به مدت ۲ ساعت و ۳۰ دقیقه در گزیلول^[۳۸] قرار داده شدند.
نفوذ دهی پارافین: بعد از صاف کردن پارافین ذوب شده در آون با حرارت C ˚ ۶۰، نمونه ها دو نوبت و هر بار به مدت دو ساعت در آن قرار داده شد.
قالب گیری: نمونه ها در داخل قالب های فلزی توسط پارافین مذاب، قالب گیری گردیدند. پس از سرد شدن و جامد شدن پارافین ها، بلوک های آماده شده از قالب ها خارج و در یخچال نگهداری شدند.
برش گیری : برش هایی به ضخامت ۶ میکرومتر توسط میکروتوم^[۳۹] تهیه شد و به منظور رفع چین خوردگی، برش ها به حمام آب ۵۰ درجه منتقل شدند و سپس به صورت تصادفی بر روی لام های آغشته به چسب آلبومین^[۴۰] قرار گرفتند و تا زمان خشک شدن در دمای اتاق نگهداری شدند.
رنگ آمیزی: به منظور مطالعه لام ها با میکروسکوپ نوری، از رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین استفاده شد. مراحل انجام رنگ آمیزی و زمان های آن بصورت خلاصه در جدول (۲-۱) قید شده است.پس از انجام مراحل ذکر شده در جدول (۲-۱) لامل ها با بهره گرفتن از چسب انتلان بر روی لام چسبانده شدند.