۴-۷-۲- سنجش فعالیت آنزیم لیپاز
فعالیت لیپازی با بهره گرفتن از هیدرولیز p-nitrophenylemyristate و به طریق اسپکتروفتومتری تعیین گردید.
معرف :

 

 

  • محلول سوبسترا

 

 

شامل ۵۳/۰ میلی مولار از p-nitrophenylemyristate، ۲۵/۰ میلی مولار از ۲- methoxy ethanol، ۵ میلی مولار از sodium cholate و ۲۵/۰ مولار Tris- HCl در pH 9 می باشد.

 

 

  • محلول n-heptane / acetone

 

 

 

    • برای تهیه این محلول ۵ قسمت از استون با ۲ قسمت از ان- هپتان با هم مخلوط شدند. این محلول بعلت نقطه تبخیر پایین باید در ظروف درب دار نگهداری شود.

پایان نامه - مقاله - پروژه

 

 

 

  • روش کار

 

 

 

  • برای هر سنجش لیپازی ۵ میکرولیتر از عصاره آنزیمی به ۵/۰ میلی لیتر محلول سوبسترا اضافه و به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد انکوباسیون شدند سپس واکنش با افزودن ۷/۰ میلی لیتر از محلول (v/v ، ۵:۲) n- heptane/ acetone متوقف گردید. مخلوط واکنش بعد از هم زدن کامل به مدت ۲ دقیقه درg 6080 و در دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفوژ شد و میزان جذب لایه ماوی (aquatic) زیرین در ۴۰۵ نانومتر قرائت گردید (Iijiama، ۱۹۹۸).

 

 

 

  • شاهد نیز مانند نمونه بالا آماده سازی شد با این تفاوت که محلول آنزیمی پس از افزودن محلول (v/v ، ۵:۲) n- heptane / acetone به لوله آزمایش اضافه شد.

 

 

 

 

 

حجم محلول درون کوت (ml) * 1000* (مدت زمان انکوباسیون / ( nm405) میزان جذب)

 

= میزان پروتئین (mg) / فعالیت آنزیمی (U)

 

 

 

میزان پروتئین در نمونه (mg) * 16500

 

 

 

۱۶۵۰۰ ضریب ثابت مولکولی یا ضریب تاریکی برای پارا- نیتروفنل است.
۵-۷-۲- سنجش فعالیت آنزیم پروتئاز :
سنجش فعالیت آنزیم پروتئاز با استفتده از محلول سوبسترا آزوکازئین ۵/۱% در ۵۰ میلی مولار بافر Tris/Hcl در۵/۷ = pH پذیرفت. ۲۰ میلی لیتر از نمونه عصاره آنزیمی با ۵/۰ میلی لیتر بافر Tris/Hcl در دمای ۲۵ درجه سانتیگرا مخلوط شد. سپس ۵/۰ میلی لیتر از محلول TCA (Trichloroacetic acide) می شود که این آغاز واکنش است. پس از ۱۰ دقیقه انکوباسیون در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد میکروتیوبها در دستگاه سانتریفیوژ میکروتیوب (اسم دستگاه) به مدت ۵ دقیقه با سرعت g × ۶۵۰۰ سانتریفیوژ شدند. و سپس محلول رویی میکروتیوبها را داخل میکرپلت ته صاف ریخته و میزان جذب با دستگاه اسپکتوفتومتری مدل(اسم دستگاه) با طول موج ۴۴۰ نانومتر قرائت شدند. برای گروه شاهد نیز از آب مقطر استفاده می شد. و در نهایت میزان فعالیت آنزیمی با تعیین میزان جذی نوری در طول موج ۴۴۰ نانومتر به ازای مدت انکوباسیون (۱۰دقیقه) و میزان پروتئین عصاره آنزیمی (میلیگرم) محاسبه می شود(Garcia-carreno et al,1993) .
۸-۲- بررسی­های ایمنی شناسی
در پایان دوره ۹ ماهی از هر تیمار به طور تصادفی انتخاب شده و پس از بیهوشی در محلول پودر گل میخک اقدام به خونگیری شده نمونه خون وریدی اخذ شد و سپس سرم نمونه خون جدا شده و تست لیزوزیم و فعالیت راه میانبر سیستم کمپلمان مورد ارزیابی قرار گرفت.
۱-۸-۲- خون گیری و تهیه سرم
پس از بیهوشی ماهیان، خونگیری در شرایط استریل از ورید ساقه دمی با بهره گرفتن از سرنگ یکبار مصرف با سر سوزن سایز ۲۲ صورت گرفت. پس از خون گیری، خون به یک لوله استریل منتقل و اجازه داده شد به مدت یک ساعت در دمای اتاق منعقد گردد. سپس ۵ ساعت دیگر در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد. در پایان این مدت برای تهیه سرم نمونه­ها با دور g× ۱۵۰۰ به مدت ۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند.
۲-۸-۲- فعالیت راه میانبر سیستم کمپلمان:
فعالیت راه میانبر کمپلمان بر اساس همولیز گلبول­های قرمز خرگوش (RaRBC) و به کمک Boesen وهمکاران (۱۹۹۹) و Amarوهمکاران (۲۰۰۰) اندازه گیری شد. به طور خلاصه، گلبول­های قرمز خرگوش سه مرتبه با بافر اتیلن گلیکول تترا استیک اسید- منیزیوم- ژلاتین ورونال (۱۰/۰ مولار، ۷=pH، شسته شده و تعداد سلول­های آن به کمک لام نئوبار در هر میلی لیتر بافر cell/ml 108 × ۲ تنظیم شد. ابتدا دانسیته نوری[۱۴] لیز درصد گلبول­های قرمز خرگوش با افزودن ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون فوق به ۴/۳ میلی لیتر آب مقطر تعیین گردید. برای اینکار مخلوط فوق با دور g×۱۶۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شده و دانسیته نوری محلول رویی در طول موج ۴۱۴ نانومتر به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر محاسبه شد. سپس نمونه­های سرم ابتدا ۱۰۰ مرتبه با بافر فوق رقیق شدند. حجم­های متفاوتی از آن در هفت لوله آزمایش استریل تهیه شده و حجم همه لوله­ها به کمک بافر به ۲۵۰ میکرولیتر رسانده شد. سرانجام به همه لوله­ها ۱۰۰ میکرولیتر گلبول قرمز خرگوش اضافه گردید. مخلوط فوق به مدّت ۹۰ دقیقه در دمای ۲۰ درجه سانتیگراد انکوبه شد. در این مدت به طور متناوب هر ۱۵ دقیقه یکبار لوله­ها تکان داده شدند. در پایان به هر کدام از لوله­ها ml 15/3 محلول ۸۷/۰ درصد کلرید سدیم اضافه شد. سپس لوله­ها با دور g×۱۶۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه و دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شده و دانسیته نوری محلول رویی با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۴۱۴ نانومتر محاسبه شد. برا ی محاسبه میزان فعالیت راه میانبر سیستم کمپلمان با بهره گرفتن از کاغذ شطرنجی[۱۵] منحنی لیز رسم شد. طبق تعریف حجمی از سرم که سبب ۵۰ درصد همولیز شود عبارتست از فعالیت کمپلمان نمونه و از رابطه زیر محاسبه شد:
۵/۰ × (فاکتور رقت) × K = (U/ml) ACH505
در رابطه فوق K مقداری از سرم بر حسب ml است که موجب ۵۰ درصد همولیز می­ شود. ۵/۰ عدد ثابت بوده و فاکتور رقت در این تست ۰۱/۰ می­باشد چون سرم ۱:۱۰۰رقیق شده است.
نحوه تهیه بافرها

 

 

  • بافر PBS

 

 

جدول ۵-۲- ترکیب بافر PBS

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...