۴-۲-۳-مشاهدات میکروسکوپی و ماکروسکوپی
مشاهدات ماکروسکوپی نشان دهنده تغییر رنگ محیط از سبز روشن به قرمز تیره می­باشد که این تغییر رنگ حاصل از اکسیداسیون آهن دو ظرفیتی به آهن سه ظرفیتی با کاهش pH و افزایش مقدار E_h همراه بود. همانگونه که در شکل (۴-۲) مشخص است رنگ محیط در ابتدا سبز روشن است و بعد از گذشت یک هفته به اکسیداسیون کامل(۴-۲- ج) می رسد.
ج
ب
الف
شکل ۴-۲) مراحل تغییر رنگ محیط کشت: الف) زمان اولیه تلقیح باکتری به محیط کشت،ب) محیط کشت بعد از گذشت۳ روز،ج) اکسیداسیون کامل آهن و تغییر رنگ محیط به قرمز تیره بعد از گذشت یک هفته مقدار Eh از ۲۰۰+ میلی ولت به ۶۰۰+ میلی ولت طی گذشت ۷ روز افزایش یافت. که طبق E_h: Fe⁺³/Fe⁺² نشان­دهنده میزان و سرعت اکسیداسیون آهن می­باشد.
جدول ۴-۲) تغییرات pH و E_h در طول رشد باکتری

شکل ۴-۳) رشد جدایه بر روی محیط ۹Kجامد. کلنی­های زرد با مرکز قهوه­ای به عنوان باکتری­ های اکسیدکننده آهن درنظر گرفته شده است
نتایج حاصل از تغییرات pH و E_h نشان دهنده فعالیت باکتری بود، همچنین باکتری جدا شده قادر به تشکیل کلنی­های کوچک با رنگ زرد با مرکزیت قهوه­ای بود(شکل ۴-۳). این جدایه در کلکسیون میکروارگانیسم های دانشگاه تهران با کد UTMC2299 ثبت و نگهداری گردید.
۴-۳-شناسایی جدایه UTMC2299 به روش فیلوژنتیکی
۴-۳-۱-استخراج DNA ژنومی از جدایه UTMC2299
پس از استخراج DNA ژنومی ، محصول استخراج برای تأیید وجود DNA بر روی ژل برده شد و نتایج آن مطابق شکل زیر حاکی از به درستی انجام شدن استخراج DNA می­باشد. بر روی ژل آگارز برده شد و بعد از رنگ آمیزی توسط اتیدیوم بروماید، باندهای DNA به صورت تصویر زیر دیده شد.

شکل ۴-۴) تصویر ژل مربوط به استخراج DNA. که مربوط به DNA ژنومی استخراج شده از جدایه UTMC2299 می­باشد.
با توجه به شکل بالا مشاهده می­ شود که استخراج DNA از این باکتری به خوبی صورت گرفته است. در روش استخراج DNA برای این باکتری از لیزوزیم استفاده نشد، در صورت استفاده از لیزوزیم باندی بر روی ژل مشاهده نگردید، همچنین زمان دمای انکوباسیون برای استخراج DNA از این باکتری به ۴/۱ زمان دمای موجود در دستورالعمل اعمال شد.
۴-۳-۲-انجام PCR روی DNA استخراج شده جدایه UTMC2299:
مقدار DNA با دو نسبت ۰٫۲۵ میکرولیتر و ۰٫۵ میکرولیتر PCR شد. در ادامه محصول استخراج DNA به­دست آمده، برای انجام کلونینگ برای تعیین توالی دقیق آن مورد استفاده قرار گرفت.
همانگونه که دیده می­ شود باند ژنی ۱۵۰۰ تایی مشاهده گردید، که در ادامه نتایج Blast آن نشان دهنده نوع باکتری جداشده می­باشد
شکل ۴-۵) تصویر حاصل از PCR ژن جدایه UTMC2299
۴-۳-۳-کلون کردن محصول PCR جدایه UTMC2299
معمولا در مرحله توالی­یابی ۷۰ نوکلئوتید از ابتدا و انتهای توالی­ها به­خوبی خوانده نمی­ شود. برای دستیابی به توالی دقیق سویه جدا شده انجام کلونینگ لازم می­باشد. بدین منظور DNA جدا شده در میزبان ٍE.coli کلون گردید.
از آنجایی که طول ژن جدا شده ۱۵۰۰ نوکلئوتید است کلون­های مثبت سفید رنگ باندهای حدود۱۵۰۰ نوکلئوتیدی ایجاد کنند. در شکل زیر نتیجه حاصل از ژل الکتروفورز ۱۰ کلنی سفیدرنگ انتخاب شده برای سویه جداسازی شده مشاهده گردید.
شکل ۴-۶) تصویر ژل کلونینگ با باندهای ۱۵۰۰ نوکلئوتیدی