جدول۵-۳- دوره های دمایی واکنش های PCR.

۳-۴-۱۱- تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR

برای بررسی محصول PCR، ژل آگارز ۱ درصد(w/v) به شیوه زیر تهیه شد:
۱- مقدار یک گرم آگارز در ۱۰۰ میلی لیتر بافر X1 TBE (8/10 گرم تریس، ۵/۵ گرم بوریک اسید و ۷۳/۰ گرم EDTA در ۱۰۰۰ میلی لیتر آب، ۳/۸ pH=)، حل و چند دقیقه جوشانده شد. محلول ژل، به آرامی درون قالبی که دو سوی آن با چسب بسته شده بود، ریخته شد.
۲- پیش از انجماد ژل، شانه ویژه، درون محلول ژل، فرو برده ‌شد، به گونه‌ای که لایه نازکی از ژل در قسمت‌های زیرین شانه، وجود داشته باشد. پس از انجماد ژل، چسب‌ها از دو سوی ژل برداشته و شانه به آرامی بیرون آورده ‌شد. ژل همراه با قالب خود در تانک الکتروفورز قرار گرفت تا اندازه‌ای با بافر X1 TBE پر شد که ارتفاع بافر روی سطح ژل به چند میلی متر برسد.
۳- مقدار ۵ میکرولیتر از فرآورده‌های PCR با ۲ میکرولیتر بافر بارگذاری (برومو فنول بلو ۲۵/۰ درصد، گلیسرول ۳۰ درصد) آمیخته و در چاهک‌های ژل ریخته شدند. سپس ولتاژ دستگاه در ۹۰-۸۰ ولت تنظیم و ۴۵ الی ۶۰ دقیقه، الکتروفورز شد.
پس از پایان زمان الکتروفورز، ژل با بهره گرفتن از دستگاه Gel Documentation بررسی و از آن عکس برداری شد. با کمک نشانگرهای DNA (که همراه نمونه‌ها در ژل، بارگذاری شده بود)، وزن مولکولی قطعه تکثیر شده اندازه‌گیری شد.

۳-۴-۱۲- آزمون شیمیایی- بافتی برای تعیین فعالیت تراژن GUS در شاخسارههای تراریخت

این آزمون مطابق با روش پیشنهادی جفرسون و همکاران^[۵۸] (۱۹۸۷) و به ترتیب زیر انجام شد.
۱- ابتدا یک برگ به طور کامل باز شده از هر شاخه برداشت شد. در هر بار آزمون رنگ آمیزی ۲ تا ۳ برگ از گیاه توتون تراریخت شده با GUS به عنوان شاهد استفاده گردید.
۲- سپس قطعه های برگی در لوله های اپندورف ۵/۱ میلی لیتری قرار داده شدند. ۵۰۰ میکرولیتر از بافر سنجش (جدول ۱-۳) روی نمونه ها ریخته شد.
۳- برای هواگیری از قطعه های برگی و در نتیجه نفوذ بهتر بافر سنجش به بافت های برگی، صفحه های شیشه ای در شرایط خلأ قرار داده شدند. هواگیری بافت های برگی ۳ تا ۴ مرتبه (هر بار به مدت ۱۵- ۱۰ دقیقه) و تا خروج کامل حباب های هوا از قطعه های برگی صورت گرفت. به طوری که پس از اتمام کار تمام قطعه های برگی در ته لوله های اپندورف قرار گرفتند.
۴- نمونه ها در شرایط تاریکی و دمای ۳۷ درجه سلسیوس به مدت یک شب نگهداری شدند.
۵- پس از یک شب، بافر سنجش به طور کامل از چاهک ها خارج و بی درنگ بافر تثبیت کننده (شامل ۵% فرمالدهید، ۵% اسید استیک خالص و ۲۰% اتانول) به چاهک ها افزوده و به مدت دو ساعت در دمای اتاق نگهداری شد.
۶- پس از گذشت دو ساعت بافر تثبیت کننده به طور کامل خارج و به هر چاهک اتانول ۵۰% افزوده شد و به مدت دو ساعت در دمای اتاق نگهداری شد.
۷- در این مرحله دوباره اتانول۵۰% به طور کامل از چاهک ها خارج و برای شفاف شدن
قطعه های برگی، چندین بار الکل خالص به چاهک ها افزوده و تعویض شد. از قطعه های برگ درون چاهک های صفحات شیشه ای عکس گرفته شد و فعالیت ژن GUS با توجه به شدت رنگ ارزیابی شد.

۳-۴-۱۳- واکاوی داده ها

به منظور بررسی تأثیر غلظت باکتری، چگالی نوری (۵/۰، ۸/۰ و ۱)، زمان مایه زنی (۲۰، ۳۰ و ۴۰ دقیقه) و مدت زمان هم کشتی (۲، ۳ و ۴ روز) بر درصد شاخساره های تراریخت آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح به طور کامل تصادفی با سه تکرار اجرا شد. برای انجام تجزیه آماری داده ها از نرم افزارهای SAS و Minitab استفاده شد. مقایسه های میانگین داده ها در سطح احتمال ۵ % با آزمون LSD انجام گرفت. نمودارها با بهره گرفتن از نرم افزار Excel رسم شدند.
فصل چهارم

۴- نتایج و بحث

۴-۱- کشت بافت

۴-۱-۱- تشکیل شاخساره نابجا از ریزنمونه های برگ ارقام استاندارد و مینیاتور میخک

۴-۱-۱-۱- مواد گیاهی

با بهره گرفتن از ریز نمونه برگ’ Rendz-Vous‘ و ’Panamera‘یک روش باززایی کارآمد برای ارقام استاندارد و مینیاتور ارائه شد. در این روش با صرف کمترین هزینه و پیشگیری از تراکم کار تشکیل شاخساره های نابجا از ریزنمونه های برگ به دست آمد.

۴-۱-۱-۲- گندزدایی

بهترین تیمار برای گندزدایی بدین شرح بود: ریزنمونه ها پس از شستشوی ابتدایی به مدت ۱۰ دقیقه در محلول آب و ریکا (۵ قطره برای ۵/۰ لیتر) قرار گرفته و سپس به مدت ۲۰ دقیقه در محلول بنومیل (۱ گرم در لیتر) روی همزن قرار گرفتند. پس از شستشو با آب مقطر نمونه ها به زیر هود استریل انتقال یافتند. ابتدا با اتانول ۷۰% به مدت ۴۵ ثانیه و به دنبال آن در کلراکس (حاوی ۵ گرم کلر فعال) ۱۰% به اضافه توین ۲۰ (۲/۰%) به مدت ۱۰ دقیقه گندزدایی سطحی و سپس سه بار با آب دو بار تقطیر شده آبکشی شدند.

۴-۱-۱-۳- ریزنمونه ها و محیط باززایی

ریزنمونه های برگ از گیاهان رشد یافته در شرایط گلخانه با سن ۶ تا ۸ هفته برداشت شدند و روی محیط باززایی MS دارای ۳۰ گرم در لیتر سوکروز، ۸ گرم در لیتر آگار و تنظیم کننده های رشد بنزیل آدنین^[۵۹] و نفتالن استیک اسید^[۶۰] با غلظت های ۱/۰، ۳/۰ و ۹/۰ میلی گرم در لیتر کشت شدند. پس از ۶ تا ۸ هفته شاخساره های نابجا از سطوح برش خورده ریزنمونه ها باززایی شدند. هر تیمار شامل ۲۵۰ ریزنمونه بود.
در این پژوهش اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر میانگین تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریزنمونه های برگ ارقام استاندارد’Rendz-Vous‘ و مینیاتور’Panamera ‘بررسی شد. نتایج نشان داد که این اثر در سطح ۵% معنی دار است اما برهمکنش بین این دو تنظیم کننده رشد معنی دار نیست و اثرهای BA ممکن است جدای از NAA باشد. میانگین تعداد شاخساره های نابجا با افزایش غلظت BA به ۹/۰ میلی گرم در لیتر افزایش می یابد در صورتی که برای NAA بیشترین تعداد شاخساره های نابجا در غلظت ۳/۰ میلی گرم در لیتر به دست آمده و با افزایش غلظت آن کاهش می یابد (جدول ۱-۴). روش به کار برده شده در این پژوهش به احتمال می تواند با موفقیت برای دیگر ارقام متعلق به تیره میخک به کار رود. همچنین نتیجه گرفته شد که بین ظرفیت باززایی برگ های ارقام مختلف همبستگی وجود ندارد.
جدول ۱-۴- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریزنمونه های برگ رقم استاندارد‘Rendz-Vous‘ .

غلظت تنظیم کننده رشد (mg L^-1)

میانگین تعداد شاخساره های نابجا

BA

NAA