در بعضی گونه های گیاهی، پاسخ ریخت زایی به شدت زیر تأثیر سن و مراحل فیزیولوژیک گیاه مادری قرار می گیرد. نشان داده شده است که وجود ABA در محیط کشت حساسیت رویان زایی را با سن ریزنمونه کاهش می دهد (Nishiwaki et al, 2000).
تیمارها و مدت زمانی که مواد گیاهی در برابر تنظیم کننده های رشد قرار می گیرند در پاسخ ریخت زایی مشاهده شده مؤثر است (Victor et al, 1999). مکان برگ ها روی گیاه دارای اهمیت است. در پژوهشی که توسط آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1992) صورت گرفت جوان ترین برگ ها زیر مریستم انتهایی بهترین درصد باززایی را داشتند.
فیشر و همکاران (Fisher et al, 1992) بیان داشتند که شرایط کاشت بیش از ظرفیت ریخت زایی[۳۲] قسمت های گلبرگ بر باززایی شاخساره اهمیت دارد. آن ها همچنین بیان کردند که کارایی بالای باززایی و انگیزش سریع شاخساره به هوادهی مناسب و تماس بهتر ریزنمونه با محیط مایع بستگی دارد.
نانتاسواستری و همکاران (Nontaswatsri et al, 2002) پیشنهاد کردند که گره بالایی نسبت به گره پایین تر توانایی باززایی شاخساره بیشتری دارد. آن ها همچنین بیان داشتند که در ریزنمونه های برگ و تک گره سرآغازه های شاخساره[۳۳] از ناحیه انتقالی بین پایه برگ و ساقه باززایی شدند.
۲-۱-۴- مسیرهای رویان زایی بدنی
به طور معمول رویان زایی بدنی از دو مسیر متفاوت صورت می گیرد. در رویان زایی مستقیم از تشکیل پینه دوری می شود، اما رویان زایی غیرمستقیم همراه با تشکیل پینه است (Chawla, 2000 ؛ Chen and Chang, 2004). رویان زایی مستقیم برای افزایش انبوه مناسب تر است زیرا گوناگونی ژنتیکی آن در مقایسه با رویان زایی غیرمستقیم که بیشتر نقص در تعداد کرموزوم در طول کشت را نشان می دهد، محدودتر می باشد (Chawla, 2000؛ Tanaka et al, 2000).
آپارنا و کوتاری (Pareek and Kothari, 2003) انگیزش مستقیم رویان های بدنی را روی محیط کشت MS مایع دارای ۱ میلی گرم در لیتر ۲,۴-D گزارش کردند.
۲-۲- انتقال ژن توسط اگروباکتریوم
مهندسی ژنتیک یک روش نوید بخش برای بهبود ژنتیکی گل میخک می باشد، زیرا بهبود آن با بهنژادی سنتی به میزان قابل توجهی با محدودیت مواجه است. امروزهA. tumefaciens به عنوان مؤثرترین مهندس ژنتیک گیاهی در طبیعت مطرح شده است (Chawla, 2000).
جنس Agrobacterium به عنوان ناقل ژن برای یاخته های گیاهی به خوبی شناخته شده است. اگروباکتریوم ها باکتری های میله ای، گرم منفی و متعلق به تیره Rhizobiaceae می باشند. دسته بندی آن ها بر اساس ویژگی های بیماری زایی به شرح ذیل می باشد:
الف- Agrobacterium tumefaciens: عامل بیماری گال طوقه
ب- A. rhizogenes: عامل بیماری ریشه مویی
ج- A. radiobacter : سویه غیر بیماری زا
۲-۲-۱- اساس ایجاد گال و پلاسمید Ti
اسمیت و تانسند (Smith and Townsend, 1907) نشان دادند که عامل ایجاد سرطان های گال طوقه، یک باکتری است. آزمایش های براون و همکاران (Braun and Stonier, 1958) نشان داد که برای حفظ گال، نیازی به حضور مداوم باکتری های زنده نیست. در طول فرایند انتقال یک قطعه ویژه از پلاسمید باکتری به نام T-DNA (DNA منتقل شونده) که می تواند حاوی یک ژن نشانگر گزینشگر[۳۴]، ژن های گزارشگر[۳۵] و یا ژن های مطلوب دیگر باشد به داخل ژنوم هسته ای سلول های میزبان انتقال می یابد. اولین بار زانن و همکاران (Zaenene et al, 1974) بیان داشتند که سویه های بیماری زای A. tumefaciens پلاسمیدهای بزرگی را در خود جای داده اند و ویژگی بیماری زایی در پلاسمید وجود دارد.
وقتی که پلاسمید را از باکتری حذف می نمایند، بیماری زایی نیز به دنبال آن حذف می شود. پلاسمید بزرگ موجود در این باکتری را پلاسمید گال زا[۳۶] می نامند، که توانایی بیماری زایی را به باکتری ناقل می بخشد (Chawla, 2000). وجه مشخص بیماری گال طوقه که توسط این باکتری ایجاد می شود، افزایش نامحدود یاخته های گیاهی (شکل گیری گال) است. بافت گال ای گال طوقه که به طور طبیعی تراریخت شده است، از توانایی رشد خود به خودی روی محیط کشت های مصنوعی فاقد هورمون های اکسین و سیتوکینین برخوردار بوده و از این نظر با بافت های ناتراریخت تفاوت دارد (Chawla, 2000).
۲-۲-۲- انتقال T- DNA
انتقال T- DNA با ورود باکتری ها به یک زخم گیاهی شروع می شود. ایجاد زخم، دست کم در ناحیه ای از گیاه، یک رویداد ضروری برای فرایند انتقال است و ممکن است تا حدی برای ساخته شدن ترکیبات توسط گیاه که بیان ژن های Virرا تحریک می نماید مورد نیاز باشد (Dai et al, 2001). دوتا از فعال ترین این مواد استوسیرینگون[۳۷] و بتاهیدروکسی استوسیرینگون [۳۸] می باشند. در اثر زخم شدن بافت گیاهی انگیزاننده های فنولی ترشح شده که سبب فعال شدن ژن های Vir گردیده و این ژن ها سبب انتقال T-DNA به درون ژنوم گیاه میزبان می شوند. به طور کلی انتقال ژن ها توسط اگروباکتریوم در مقایسه با روش های انتقال مستقیم (مانند فن بمباران ذره ای[۳۹]) دارای برتری های زیر می باشد:
الف- این روش یک ابزار طبیعی برای انتقال است.
ب- این باکتری از توانایی آلوده سازی یاخته ها، بافت ها و اندام های گیاهی سالم برخوردار بوده و بر این اساس باززایی گیاهان تراریخت با سرعت بیشتری صورت می گیرد.
ج- اگروباکتریوم قادر است قطعه های بزرگ DNA را با کارایی زیاد و بدون باز ترکیبی های قابل توجه به گیاه انتقال دهد.
د- الحاق T- DNA یک فرایند به نسبت دقیق است.
ه- پایداری ژن های منتقل شده عالی است.
و- انجام آن ساده و اقتصادی است.
ز- تولید گیاهان تراریخت با باروری بهتر.
ح- ایجاد تعداد نسخه کمتر از ژن منتقل شده به درون کروموزوم های گیاه (Chawla, 2000؛ Arencibia et al, 1998؛ Dai et al, 2001).
به هر حال، کارآیی پایین تراریزشی و نبود سازگاری با گیاهان تک لپه ای مهم ترین عیب انتقال توسط اگروباکتریوم می باشد (Dai et al, 2001).
۲-۲-۳- عوامل مؤثر بر انتقال توسط اگروباکتریوم
انتقال کارا با این باکتری به چندین عامل از جمله نژادگان گیاه، نوع ریزنمونه، سن ریزنمونه، فنون کاربردی، روش های باززایی گیاه و … ، بستگی دارد (Gelvin, 2003).
۲-۲-۳-۱- نژادگان (ژنوتیپ)
لو و همکاران (Lu et al, 1991) بیان داشتند که سیستم تراریزشی استفاده شده برای رقم’ White Sim ‘ می تواند برای ارقام ’Crowly Sim و ’ Red Sim ‘ استفاده شود. آن ها بیان نمودند که اختلاف معنی داری در فراوانی انتقال در این ۳ رقم وجود ندارد.
۲-۲-۳-۱-۱- ریزنمونه های شروع کننده
به طور معمول، انتقال توسط اگروباکتریوم با بهره گرفتن از ریزنمونه های متفاوتی صورت می گیرد. برگ ها و گلبرگ ها (Lim et al, 2005)، بذرها و گرده ها (Li et al, 2004)، میانگره های شاخساره و نوک شاخساره (Lu et al, 1991)، لپه ها و پینه های رویان زا ( et al, 1995 Firoozabadi) به عنوان ریزنمونه برای تراریزشی با این باکتری استفاده می شوند. تراریزش میخک پیش تر با بهره گرفتن از ریزنمونه های ساقه گزارش شده بود (Lu et al, 1991). فیروزآبادی و همکاران (Firoozabadi et al, ۱۹۹۵)، با ارزیابی ریزنمونه های مختلف رقم
’Improved White Sim‘ بیان داشتند که ریزنمونه های برگ شاخساره های رشد یافته در شرایط کشت بافتی بهترین نمونه برای تراریزشی میخک می باشند. روش تراریزشی با بهره گرفتن از پایه برگ دارای چندین ویژگی کلیدی به شرح زیر است:
الف- منبع ریزنمونه در میزان زیاد و در فضای کوچک در تمام طول سال به آسانی موجود است.
ب- گیاهان میخک کامل تراریخت تولید می شود و مشکل بافت ناهمسانی وجود ندارد.
ج- کارایی تراریزشی بالا می باشد.
د- فراوانی تغییرات ریخت شناسی به وسیله این روش کاهش می یابد.
ه- روش پایه برگ به نظر می رسد مستقل از رقم است.
و- این روش به نیروی کار زیادی نیاز ندارد؛ در یک آزمایش هزاران ریزنمونه می تواند تلقیح شود و صدها گیاه تراریخت به راحتی تولید می شوند.
ز- هیچ ژن گزارشگری برای تایید گیاهان تراریخت نیاز نیست چرا که با کلروسولفورون هیچ گیاه گریخته ای مشاهده نمی شود.
ح- کلروسولفورون نسبت به G418 ماده گزینشی خیلی بهتری بود؛ و هر دوی آن ها به کانامیسین برتری داشتند (Firoozabadi et al, ۱۹۹۵).
آرچنا و کوتاری (Archena and kothari, 2002) بیان داشتند که ریزنمونه های برگ اهداف مناسبی برای تشکیل شاخساره نابجا و انتقال ژن توسط اگروباکتریوم محسوب می شوند. در پژوهشی تلاش برای باززایی گیاهان تراریخت به وسیله آلودگی قسمت های گل و ساقه با A. tumefaciens و A. rhizogenes موفق نبود، بنابراین در این پژوهش از پایه های برگ استفاده شد.
آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1994) از ریزنمونه های برگ و گلبرگ به عنوان مواد شروع کننده برای آزمایش تراریزشی استفاده نمودند. آن ها بیان داشتند که ریزنمونه های گلبرگ مواد شروع کننده مناسبی برای تراریزشی میخک نیستند و جوان ترین برگ ها بیشترین حساسیت را برای آلودگی با A. tumefaciens دارند. آن ها حاوی یاخته های تمایز نیافته با نرخ بالای تقسیم می باشند. این یاخته ها به طور کلی در پایه برگ ها وجود دارند.
آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1994)، نتیجه گرفتند که شاخساره های تراریخت به دست آمده از ریزنمونه های گلبرگ پرآب[۴۰] بوده، دارای رشد آهسته می باشند و همچنین تولید تعداد شاخساره جانبی محدودی نمودند. از گیاهان تراریخت تولید شده تنها یک گیاه به گلخانه انتقال یافت و زنده ماند. به هر حال رشد این گیاهان متوقف شده و تولید گل های دارای بلوغ زودرس نمودند. آن ها همچنین بیان داشتند که با وجود توانایی ریزنمونه های گلبرگ برای به دست آوردن گیاهان تراریخت پس از آلودگی با A. tumefaciens ، آن ها برای تراریختی و انتقال ژن به سبب پرآبی و گلدهی پیش از بلوغ مناسب نیستند. در عوض ریزنمونه های برگ دارای کارآیی بیشتری برای تراریزشی با باکتری و تولید گیاهان سالم و قابل انتقال به گلخانه می باشند (Altvorst et al, 1994).
۲-۲-۳-۱-۲- سویه باکتری
یکی از مهم ترین عوامل مؤثر بر فراوانی انتقال توسط اگروباکتریوم سویه باکتری می باشد. نادولسکا و ارزیک (Nadolska and Orczyk, 2000) بیماری زایی ۴ سویه Agrobacterium یعنی LBA4404، C58C1 ، EHA105 و EHA101 را مورد مقایسه قرار داده و بیان نمودند که کارایی تراریزشی در بالاترین حالت (۲/۸ گیاه تراریخت به ازای ۱۰۰ ریزنمونه) زمانی که از سویه بیش از حد بیماری زای EHA105 استفاده شود، می باشد.
آن ها همچنین خاطر نشان نمودند که سویه های EHA 101 و EHA 105 کارایی بیشتری نسبت به سویه LBA 4404 برای انتقال به یاخته گیاهی دارند (Nadolska and Orczyk, ۲۰۰۰). زیرا دو سویه ذکر شده از سویه بیش از حد بیماری زای وحشی A 281 (Hood et al, 1993)، به دست آمده اند در صورتی که سویه LBA 4404 از سویه کمتر بیماری زای Ach5 به دست آمده است (Hoekema et al, 1983).
